Метод екстракорпорального запліднення і перенесення ембріона (ембріонів) у порожнину матки

Показання для застосування методу

Жіноче безпліддя:

1. Абсолютне трубне безпліддя (відсутність маткових труб або їх непрохідність).
2. Безпліддя, яке обумовлено ендометріозом (при безуспішній медикаментозній терапії).
3. Ендокринне безпліддя (при безуспішній гормонотерапії).
4. Безпліддя незрозумілої етіології.
5. Безпліддя, обумовлене цервікальним фактором (при безуспішному лікуванні шляхом внутрішньоматкової інсемінації).
6. Абсолютне безпліддя, обумовлене відсутністю або функціональною неповноцінністю яєчників, у цих випадках екстракорпоральне запліднення і перенесення ембріонів буде включати використання донорських ооцитів чи ембріонів.

Чоловіче безпліддя:

1. Олігоастенозооспермія 1-2 ст.

Протипоказання для застосування методу

1. Соматичні і психічні захворювання, що є протипоказаннями до виношування вагітності (за висновком профільного спеціаліста).

2. Вроджені аномалії: повторне народження дітей з однотипними вадами розвитку; народження раніше дитини з хромосомними аномаліями; домінантно успадковані захворювання в одного із батьків з високим ступенем пенестрантності (за висновком лікаря - генетика).

3. Спадкові захворювання: гетерозиготне носійство у подружжя по всіх багатогенних захворюваннях (порушення амінокислотного, вуглеводного, гліколіпідного, глікопротеїдного обмінів). Народження раніше дітей з успадкованими захворюваннями, (гемофілія, міопатія типу Дюшена та ін.), за висновком лікаря-генетика.

4. Пухлинні і гіперпластичні стани матки і яєчників.

5. Пороки розвитку матки (за висновком лікаря акушера-гінеколога).

6. Статевий інфантилізм (довжина тіла матки менш 35 мм).

7. Синехії порожнини матки.

8. Вік жінки більше 40 років.

Пункція і аспірація вмісту фолікулів

Пункція проводиться в операційній, оснащеній всім необхідним інструментарієм і обладнанням для екстреної медичної допомоги, з дотримуванням правил асептики у положенні на гінекологічному кріслі.

Пункція проводиться із знеболюванням під місцевою анастезією або короткочасним внутрішньовенним наркозом.

Вибір методу знеболювання вирішується індивідуально в залежності від характеру відповіді яєчника на стимуляцію суперовуляції (кількості фолікулів), психологічного стану пацієнтки.

Отримання яйцеклітини із аспірованої фолікулярної рідини

Після аспірації, одразу ж, вміст фолікулів доставляється із операційної до ізольованої лабораторії, яка з'єднана з операційною.

Аспірований вміст фолікулів оглядається під стереолупою.

Виявлені ооцити переносять за допомогою пастерівської піпетки або спеціального капіляра в стерильні чашки Петрі, що вміщують поживне середовище, яке еквіліброване в атмосфері з 5% CO2 і температурою 37 град.C, при вологості 98% протягом 12-20 годин (такі умови створюються спеціальним автоматичним CO2 інкубатором).

В чашку для культивування переноситься не більше 2-3 яйцеклітин. Після перенесення чашки маркують і знову вміщують в інкубатор на 6-7 годин до інсемінації.

Всі маніпуляції з клітинами, чашками, середовищами та ін. проводяться у спеціальному боксі з потоком стерильного повітря.

Маніпуляції повинні займати не більше 1 хвилини.

Підготовка сперми до інсемінації, інсемінація

Метод обробки сперми включає такі процедури:

1. Зразок сперми досліджується мікроскопічно на концентрацію сперматозоїдів, їх рухливість, морфологію, кількість лейкоцитів у зразку.
2. При нормальній якості зразка 1 мл його стерильною піпеткою переноситься у центрифужну пробірку з 2 мл інсемінаційного середовища, ретельно зміщується, потім центрифугується протягом 10 хвилин з прискоренням 3000 (об/хв).
3. Стерильною піпеткою збирається супернатант, який утворився при центрифугуванні. До пелету додається 2 мл свіжого інсемінаційного середовища, далі центрифугується ще 10 хвилин при 1500 об/хв.
4. Супернатант прибирається, на пелет обережно нашаровують 1 мл інсемінаційного середовища, пробірка з цим вмістом переноситься в автоматичний CO2 інкубатор та інкубується при 37 град.С, 5% CO2 і 98% вологості протягом 40-60 хвилин (за цей час найбільш рухливі сперматозоїди спливають з пелету у верхні шари інсемінаційного середовища).
5. Стерильною мікропіпеткою або шприцем деяка частина супернатанту забирається для дослідження концентрації та рухливості сперматозоїдів, що спливли.
6. Необхідний об'єм інсемінаційного середовища додається у чашку Петрі для культивування гамет і ембріонів, де у 1 мл культурального середовища знаходиться 1-3 ооцити, отриманих при пункції.
7. Культуральна чашка з гаметами вміщується в інкубатор на 18-20 годин до проведення наступних етапів культивування. Склад середовищ, які використовуються для відмивання сперматозоїдів і культивування гамет, може бути однаковий або неоднаковий, але Ph і осмополярність цих середовищ повинні бути томожні.
8. Усі маніпуляції з яйцеклітинами та спермою проводяться у стерильному одноразовому посуді та стерильним одноразовим інструментарієм.
9. Особисту відповідальність за маркування гамет несе ембріолог.

Перший день культивування та перенесення ембріонів у порожнину матки.

Через 18-20 годин після інсемінації ооцити вивільняють від клітин кумулюса, які їх оточують, для того щоб визначити наявність запліднення та його якість.

Якість запліднення визначається за кількістю пронуклеусів у ооплазмі.

Відділення клітин кумулюса робиться шляхом піпетування ооцита з оточуючим його клітинами через трохи більшу діаметром за ооцит скляну стерильну мікропіпетку, втягнуту над полум'ям.

Маніпуляції з ооцитом повинні бути дуже обережні, щоб не зруйнувати, не ушкодити ооцит.

Маніпуляції проводять з використанням стеріомікроскопа (лупи).

Після маніпуляції ооцит переноситься у чашку Петрі з культуральним середовищем для дроблення та розвитку ембріона.

Наявність двох пронуклеусів свідчить про нормальне запліднення. Зиготи, в ооплазмі яких пронуклеуси відсутні або їх більше двох, не повинні використовуватись для культивування.

Культуральні чашки маркуються прізвищем пацієнтки, кількістю зигот, які в них знаходяться, та їх якістю.

Чашки із зиготами переносяться в інкубатор для подальшого культивування.

Наступного дня після пункції (вранці) зиготи мікроскопуються на наявність дроблення.

Ембріони, які дробляться, досліджуються на кількість бластомерів, їх рівномірність, гомогенність цитоплазми або на наявність фрагментації.

Ембріони, які відібрані, переносяться в одну культуральну чашку і залишаються в інкубаторі до моменту перенесення.

Потім ембріони переносяться жінці у порожнину матки.